LAPORAN PRAKTIKUM MIKROTEKNIK PEMBUATAN PREPARAT MELINTANG DENGAN METODE PARAFIN

LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROTEKNIK TUMBUHAN

PERCOBAAN I

PEMBUATAN PREPARAT MELINTANG DENGAN METODE PARAFIN

                        NAMA                       : ASTRID SAFIRA IDHAM

                        NIM                            : H411 13 341

                        KELOMPOK                        : VII (TUJUH) A

                        HARI/TANGGAL    : RABU / 04 MARET 2015

                        ASISTEN                   : NURUL QALBY   

LABORATORIUM BOTANI

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2015

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tumbuhan terdiri atas kumpulan sel-sel, yang mempunyai asal, fungsi serta struktur yang sama dan disebut jaringan. Berdasarkan sifatnya,  ada dua macam jaringan yang menyusun tubuh tumbuhan, yaitu jaringan muda dan jaringan dewasa. Jaringan muda mempunyai sifat membelah, sehingga mempunyai fungsi menambah panjang akar maupun batang, karena biasanya terdapat pada bagian ujung. Pertumbuhan yang diawali oleh jaringan-jaringan yang letaknya di bagian ujung dikenal sebagai pertumbuhan primer, dan semua jaringan yang terbentuk jaringan primer. Tumbuhan monokotil melengkapi daur hidupnya hanya dengan pertumbuhan pimer saja, tetapi tumbuhan dikotil batang dan akar dapat mempertebal diri melalui proses yang disebut pertumbuhan sekunder (Sumardi, Pudjoarinto, 2002).

Sel tumbuhan mempunyai bentuk, ukuran dan struktur yang bervariasi. Struktur sel rumit, namun demikian semua sel mempunyai persamaan dalam beberapa segi dasar. Jaringan yang menyusun tumbuh-tumbuhan terdiri dari jaringan muda dan dewasa. Jaringan-jaringan ini dapat ditemukan pada bagian akar, batang dan daun tumbuhan. Jaringan ini dapat dilihat dengan membuat suatu preparat penampang dari bagian-bagian tumbuhan (Sugiharto, 1989).

Mikroteknik secara umum didefinisikan sebagai ilmu yang mempelajari metode pembuatan preparat mikroskopis, baik preparat hewan maupun tumbuhan, menganalisis preparat mikroskopis dan melakukan mikrometri, serta membahas manfaat preparat bagi perkembangan keilmuan dan dukungan terhadap kehidupan manusia. Sedangkan mikroteknik tumbuhan merupakan teknik dalam pembuatan preparat mikroskopis tumbuhan (Arimurti, 2001). Berdasarkan hal ini, maka dilakukanlah percobaan pembuatan preparat dengan menggunakan metode parafin.

1.2 Tujuan Percobaan

Tujuan dari percobaan ini yaitu untuk mengetahui cara pembuatan preparat pada akar tanaman jagung Zea mays dengan metode parafin.

1.3 Waktu dan Tempat Percobaan

Percobaan mengenai pembuatan preparat dengan metode parafin, dilaksanakan pada hari Rabu, 04 Maret 2015, pukul 14.00 - 17.00 WITA yang bertempat di Laboratorium Biologi Dasar, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Dalam bentuk kehidupan yang paling sederhana suatu organisme dapat terdiri dari satu sel. Setiap organisme hidup ataupun hasil pertumbuhannya merupakan suatu sumber yang penting sebagai bahan mikroteknik. Tingkat kekerasan jaringan tumbuhan pada umumnya ditentukan oleh tingkat pertumbuhannya, yang dalam hal ini berkaitan dengan derajat pengayuan (lignifikasinya). Jaringan tumbuhan berbeda dengan jaringan hewan dalam satu hal penting yaitu bahwa setiap sel tumbuhan terbungkus yang cukup tangguh yang terutama terdiri dari selulosa. Membran tersebut berasal dari sel, sedangkan membran sitoplasma yang asli, yang sesuai dengan membran luar pada sel hewan berada sedikit di sebelah dalam  (Sugiharto, 1989).

Tubuh tumbuhan secara morfologi terdiri atas unit sel yang dilindungi oleh dinding, dan masing-masing sel dengan mengadakan kesatuan dengan adanya substansi antar sel. Sel-sel dalam tubuh tumbuhan terdapat dalam kelompok yang secara struktural dan fungsional berbeda dengan kelompok sel yang lain. Kelompok-kelompok sel-sel tersebut dikenal dengan jaringan (Sugiharto, 1989).

Preparat berdasarkan sifat ketahanannya dapat dibedakan menjadi preparat sementara (preparat basah), preparat semipermanen (1/2 awetan) dan preparat permanen (awetan). Preparat sementara bersifat tidak tahan lama dan biasanya hanya untuk sekali pengamatan. Preparat ini menggunakan medium air atau bahan kimia yang mudah menguap. Preparat semipermanen menggunakan media gliserin dan mampu bertahan untuk sekitar seminggu penyimpanan. Preparat permanen atau preparat awetan merupakan preparat yang diawetkan menggunakan balsam, gliserin jelly, lactophenol atau senyawa lain sebagai agen mountingnya. Sehingga preparat permanen dapat bertahan beberapa lama (Arimurti, 2001).

Mikroteknik atau teknik histologi ini akan dipelajari ilmu atau seni untuk mempersiapkan organ, jaringan atau bagian yang lainnya untuk dapat diamati dan dipelajari dengan lebih teliti. Pada umumnya untuk melihat jaringan atau organ ini dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada dasarnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian ataupun keseluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain diletakkan pada kaca preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca penutup, yaitu sepotong kaca yang sangat tipis ataupun plastik yang tembus pandangan yang direkatkan di atas specimen  (Sugiharto, 1989).

Metode parafin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode parafin. Pembuatan preparat dengan metode parafin adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat permanen, baik pada tumbuhan ataupun pada hewan (Sugiharto, 1989).

Metode parafin saat ini banyak digunakan, karena hampir semua macam jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metoda ini. Kebaikan-kebaikan metoda ini adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin. Namun metode parafin juga memiliki kelemahan yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan metode ini (Imron, 2008).

Irisan utuh suatu spesimen sangat bermanfaat bagi studi pembelajaran. Dengan adanya preparat utuh maka dapat diamati bagian-bagian jaringan dan jenis sel yang ada dalam satu preparat. Dalam pembuatan preparat utuh diupayakan permanen atau awet agar sewaktu-waktu dapat diamati kembali.  Keberhasilan pembuatan preparat permanen ini tergantung pada lima tahap yang utama yaitu fiksasi, dehidrasi, penjernihan, perembesan dan pengeblokan parafin serta pewarnaan. Larutan fiksatif yang dipilih, perembesan parafin yang bagus dan zat warna yang akan digunakan menentukan keberhasilan preparat irisan (Imron, 2008).

Metode parafin merupakan cara pembuatan sediaan dengan menggunakan paraffin sebagai media penanaman (embedding). Langkah-langkah dalam pembuatan sediaan tersebut adalah (Rindi, 2011) :

1.        Pematian dan fiksasi

Banyak larutan yang dapat digunakan untuk fiksasi, diantaranya adalah larutan FAA (Formaldehyde Acetic-acid Alcohol), dengan komposisi sebagai berikut: 50% atau 70% etilalkohol 90 cc, Asam asetat glacial 5 cc Formalin 40 % 5 cc. Setelah bahan dipotong kira-kira 0,5 cm segera dimasukkan ke dalam larutan FAA dengan perbandingan 1: 20 (bahan 1/20 volume FAA), tidak boleh lebih delapan potong didalam vial. Lama fiksasi dalam FAA bagi bahan yang kecil atau tipis minimum 12 jam sedangkan untuk bahan yang besar atau tebal 24 jam.

2.        Pencucian

Pencucian dilakukan 2 kali dalam waktu 3 jam dengan akohol 50%. Jumlah larutan dipakai hannya tepat menutupi bahan. 

3.        Penanaman (Embedding)

Buat kotak keras yang agak tebal dengan ukuran kira-kira 5 X 2,5 X 2 cm (panjang X lebar X tinggi), lalu isi dengan paraffin keras yang cair dalam vial tadi, kemudian sebelum parafin membeku masukkan bahan. Atur bahan tersebut dalam kotak kertas dengan menggunakan jarum yang dipanaskan dengan lampu alcohol atau spritus dan beri label. Setelah parafin membeku dan bahan tidak bergoyang, letakkan kotak kertas dalam air dingin. Biarkan permukaan parafin membeku, kemudian tekanlah seluruh kotak kedalam air sampai parafin membeku, atau dapat juga dimasukkan kedalam freezer sampai seluruh parafin sama sekali membeku. Baru setelah itu parafin dapat dikeluarkan dari kotaknya.

4.        Penyayatan

Potong balok parafin menjadi balok-balok kecil yang masing-masing mengandung sebuah bahan. Balok-balok parafin itu ditempelkan pada balok kayu menurut arah sayatan yang dikehendaki. Penempelan dilakukan dengan mencairkan sebagian balok parafin dengan jarum yang telah dipanasi, kemudian meletakkan balok parafin pada kayu. Lakukan hal itu beberapa kali sehingga balok parafin menempel dengan kuat pada balok kayu. Permukaan dari balok parafin yang telah ditempelkan sebaiknya empat persegi atu bujur sangkar. Perhatikan bahwa sisi horizontal harus benar-benar sejajar. Bahan yang ada dalam balok parafin disayat dengan mikrotom putar (rotary microtome). Sebelum dipotong balok yang telah ditempeli bahan dan pisau didinginkan dahulu dengan air dingin (kulkas), sehingga suhu parafin sama dengan suhu pisau. Balok kayu yang telah ditempel dengan balok parafin dipasang pada pemegang yang terdapat pada mikrotom. Aturlah tebal sayatan (biasanya antara 6-15 mikron) dengan memutar skrup pada sisi kanan mikrotom. Pasang pisau pada mikrotom. Pada waktu pemutar mikrotom dijalankan, bahan dalam parafin yang telah diletakkan pada pemegang bergerak naik turun dan maju kedepan. Peganglah sayatan-sayatan parafin yang berbentuk pita itu dengan kuas halus. Pita parafin hasil sayatan disimpan pada kotak karton atau baki preparat. Sebaiknya pemotongan dilakukan di ruangan ber-AC.

            Terdapat kelebihan dan kekurangan dalam pembuatan preparat dengan menggunakan metode parafin diantaranya, yaitu (Imron, 2008) :

A.    Kelebihan

            Metode parafin sekarang banyak digunakan, karena hampir semua macam jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metoda ini, kelebihan dari metode  ini adalah :

·         Irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron.

·         Tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron.

·         Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila  menggunakan metode ini.

·         Prosedurnya  jauh  lebih  cepat bila dibandingkan dengan metode lainnya.

B.     Kekurangan

Metode paraffin juga memiliki kelemahan yaitu :

·         Jaringan tumbuhan menjadi keras mengerut dan mudah patah.

·          Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini.

·         Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan metode ini.

BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Alat Percobaan

            Alat yang digunakan dalam percobaan ini yaitu pipet tetes, botol sampel, gelas ukur, objek glass, deck glass, silet, dan pinset.

3.2 Bahan Percobaan

            Bahan yang digunakan dalam percobaan ini yaitu Jagung Zea mays, aquadest, alkohol, formalin, asam asetat glasial, parafin, dan xylol.

3.3 Prosedur Kerja

1.      Fiksasi FAA selama 30 menit, fiksasi ini bertujuan untuk mengawetkan semua struktur sel sehingga sedapat mungkin berada dalam keadaan sama atau hampir sama dengan pada waktu masih hidup.

2.      Pencucian dengan aquadest sebanyak 3 kali selama beberapa menit.

3.      Dilakukan dehidrasi dengan alkohol bertingkat 70%, 80%, 90%, dan 96% masing-masing 5 menit. Dehidrasi ini bertujuan untuk menarik air keluar dari jaringan dan akan digantikan dengan alkohol

4.      Dealkoholisasi dengan menggunakan alkohol-xylol perbandingan 3:1, 1:1, 1:3 masing-masing 10 menit. Dealkoholisasi ini bertujuan untuk menarik alkohol        keluar dari jaringan dan digantikan dengan xylol.

5.      Dilakukan penjernihan dengan menggunakan xylol murni. Penjernihan ini dilakukan sebanyak 2 kali yaitu xylol murni I 5 menit dan xylol murni II 5 menit. Penjernihan ini dilakukan untuk menarik sisa alkohol yang masih terdapat dalam jaringan.

6.      Infiltrasi terbagi atas infiltrasi I dan II. Infiltrasi I dilakukan dengan menggunakan xylol-parafin dengan perbandingan 1:9 kemudian dilakukan infiltrasi II yaitu dengan menggunakan parafin murni selama 30 detik. Infiltrasi   ini bertujuan untuk mengganti campuran xylol/parafin dengan parafin murni.

7.      Setelah itu dilakukan penanaman/embedding menggunakan parafin yang padat.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

a.       Gambar Penampang melintang Pada Akar Jagung Zea mays

GAMBAR (Penampang melintang Pada Akar Jagung Zea mays)	KETERANGAN
5 4 3 2 1	1.      Epidermis 2.      Kortex 3.      Floem 4.      Endodermis 5.      Xylem

b.      Gambar tahapan kerja pada pembuatan preparat dengan metode parafin

4.1.2        Rumus Perhitungan Jumlah Larutan        

1.      Rumus Pengenceran : V₁.M₁ = V₂.M₂

      Pengenceran 70 %

V₁.M₁ = V₂.M₂

V₁ x 96  = 100 x 70

96V₁ = 7000

V₁   =  7000/96

       = 72,91 mL

Banyak aquadesh yang digunakan = 100 – 72,91

                                                        = 27,09 mL

      Pengenceran 80 %

V₁.M₁ = V₂.M₂₌

V₁ x 96 = 100 x 80

96V₁ = 8000

V_1­   = 8000/96

       = 83,33 mL

Banyak aquadesh yang digunakan = 100 – 83,33

                                                        = 16,67 mL

      Pengenceran 90 %

V₁ x 96 = 100 x 90

96V₁ = 9000

V_1­ = 9000/96 = 93,75 mL

Banyak aquadesh yang digunakan = 100 – 93,75= 16,25 mL

Perbandingan alkohol xylol

      Alkohol-xylol 3:1

Alkohol yang digunakan 7,5 ml dan xylol yang digunakan 2,5 ml

      Alkohol-xylol 1:1

Alkohol yang digunakan 5 ml dan xylol yang digunakan 5 ml

     Alkohol-xylol 1:3

     Alkohol yang digunakan 2,5 ml dan xylol yang digunakan 7,5 m

4.2        Pembahasan

Mikroteknik secara umum didefinisikan sebagai ilmu yang mempelajari metode pembuatan preparat mikroskopis, baik preparat hewan maupun tumbuhan. Metode parafin merupakan cara pembuatan sediaan dengan menggunakan paraffin sebagai media penanaman (embedding). Metode parafin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode parafin. Pembuatan preparat dengan metode parafin adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat permanen, baik pada tumbuhan ataupun pada hewan.

Percobaan ini dilakukan untuk mengetahui tahapan-tahapan pembuatan preparat akar jagung Zea mays dengan menggunakan metode parafin. Akar jagung Zea mays terlebih dahulu dipotong secara melintang dengan ukuran 2 mm. Tahapan selanjutnya yaitu dilakukan fiksasi selama 20 menit. Sebenarnya berdasarkan literatur fiksasi pada akar jagung Zea mays dilakukan minimal 24 jam tetapi karena waktu yang tidak memadai dan tujuan awal hanya ingin mengetahui tahapan dalam pembuatan preparat dengan metode parafin ini maka waktu yang digunakan yaiutu 30 menit. Fiksasi pada tahapan ini bertujuan untuk mengawetkan semua struktur sel sehingga sedapat mungkin berada dalam keadaan sama atau hampir sama dengan pada waktu masih hidup.

Setelah akar jagung Zea mays difiksasi, tahapan selanjutnya yaitu pencucian dan dehisdrasi. Pada tahapan dehidrasi ini diberikan alkohol bertingkat dari 70 %, 80 %, 90 %, hingga 96 %, yang dimana tiap tingkatan alkohol dilakukan dehidrasi selama 5 menit. Pemberian alkohol bertingkat dari konsentrasi rendah hingga konsentrasi tinggi bertujuan agar selnya tidak lisis atau rusak. Alkohol bertingkat didapatkan melalui pengenceran dengan rumus V₁.M₁ = V₂.M_2. Seperti halnya pada fiksasi tadi, berdasarkan literatur dehidrasi ini minimal dilakukan 30 menit tipa tingkatan alkohol. Tahapan dehidrasi ini bertujuan untuk menarik air keluar yang berada dalam jaringan untuk digantikan dengan alkohol.

Tahapan selanjutnya yaitu dealkoholisasi dengan menggunakan alkohol-xylol perbandingan 3:1, 1:1, 1:3. Tiap perbandingan alkoho-xylol dilakukan selama 10 menit tetapi berdasarkan literatur minimal dilakukan 30 menit. Sama halnya dengan dehidrasi pada tahapan dealkoholisasi ini dilakukan dari volume alkohol yang terbanyak. Hal tersebut bertujuan agar sel atau jaringan tidak rusak. Dealkoholisasi ini bertujuan untuk menarik keluar alkohol yang berada dalam jaringan untuk digantikan oleh xylol. Hal tersebut dilakukan karena xylol yang mampu berikatan dengan parafin sedangkan alkohol tidak.

Selanjutnya yaitu penjernihan dengan menggunakan xylol murni. Penjernihan ini dilakukan 2x yaitu xylol 1 dan 2 selama 5 menit. Sama halnya dengan tahapan sebelumnya, lama penjerihan menggunakan xylol murni berdasarkan literatur yaitu 30 menit. Penjernihan bertujuan untuk memebersihkan sisa-sisa alkohol yang masih terdapat dalam jaringan. Selain itu penjernihan dilakukan dengan menggunakan xylol murni karena alkohol tidak dapat berikatan atau bercampur dengan parafin maka digantikan dengan xylol yang dapat berikatan dengan parafain melalui proses dealkoholisasi dan penjernihan

Tahapan selanjutnya yaitu infiltrasi. Infiltrasi ini terbagi atas 2 yaitu dengan menggunakan xylox-parafin dengan 1:9 dan dengan menggunakan parafin murni. Infiltrasi ini dlakukan untuk menggantikan xylol dengan parafin murni. Infiltrasi berdasarkan literatur dilakukan selama 24 jam. Setelah infiltrasi dilakukan penanaman atau biasa juga disebut dengan embedding. Embedding dilakukan dengan menggunakan parafin yang padat.

Dalam percobaan ini tahapan yang dilakukan hanya sampai embedding/penanaman karena tidak terdapatnya mikrotom yang dapat digunakan pada tahap pengirisan. Tetapi, berdasarkan literatur tahapan pembuatan preparat dengan metode parafin ini setelah embedding yaitu pengirisan dengan mikrotom dilanjutkan dengan perekatan menggunakan campuran gliseri/albumin ayng ditambahkan dengan air kemudian setelah itu dilakukan pewarnaan menggunakan safranin 1% dalam aquades.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Setelah melakukan percobaan mengenai pembuatan preparat melintang dengan menggunakan metode parafin dapat diketahui cara pembuatan preparat yaitu dimulai dengan pemotongan akar jagung Zea mays, fiksasi, pencucian dan dehidrasi, dealkoholisasi, penjernihan, infiltrasi, dan penanaman/embedding.

5.2 Saran

            Sebaiknya disediakan alat-alat laboratorium yang lebih memadai dan lengkap serta tahapan yang ada di dalam percobaan ini dilakukan dengan maksimal agar praktikum dapat berjalan dengan baik.

DAFTAR PUSTAKA

Arimurti, 2001. Laporan Praktikum Mikroteknik. Fakultas Pertanian, UGM, Yogyakarta.

Imron, Tamyis, A., 2008. Pembuatan Preparat Jaringan Tumbuhan dengan Metode Parafin. Lap.prak mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyber-biology.blogspot.com. Diakses pada tanggal 7 Maret 2015, pukul 17.00 WITA. 

Rindi, Daniswara, 2011. Membuat Preparat Organ. http://wararindi.blogspot.com

. Diakses pada tanggal 7 Maret 2015, pukul 17.00 WITA.

Sugiharto, 1989. Mikroteknik. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat            Jendral Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat Institut              Pertanian Bogor. Bogor.

Sumardi, I. dan Pudjoarinto, A., 2004. Struktur Perkembangan Tumbuhan.            Universitas Hasanuddin. Makassar.