LAPORAN BIOKIMIA PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

LAPORAN PRAKTIKUM

BIOKIMIA

PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

NAMA                       : ASTRID SAFIRA IDHAM

NIM                            : H41113341

HARI/TANGGAL    : KAMIS / 30 OKTOBER 2014

KELOMPOK            : IV (EMPAT) C

ASISTEN                   : AFMI PURWANTI

LABORATORIUM BIOKIMIA

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2014

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Asam amino merupakan monomer yang menyusun polimer-polimer pada protein. Seperti yang telah kita ketahui sebelumnya bahwa secara umum ada tiga gugus yang reaktif pada asam amino yaitu gugus karboksil, gugus amino, dan gugus rantai samping. Ketiga gugus ini dapat diidentifikasi melalui uji spesifik, diantaranya adalah dengan melalui tes ninhydrin, dan sebagainya. Akan tetapi, selain uji spesifik berdasarkan ciri khas reaksi kimianya, asam amino dapat pula diidentifikasi bahkan dipisahkan dengan beberapa metode, salah satunya adalah melalui kromatografi lapis tipis (KLT).

Pemisahan asam amino dengan metode ini didasari oleh kemampuan suatu jenis asam amino yang terlarut dalam suatu campuran pelarut tertentu pada fasa stasioner atau yang lazim disebut sebagai fasa diam, dimana bila suatu zat terlarut yang terdistribusi dalam dua pelarut dengan volume yang sama dan tidak saling bercampur sehingga perbandingan konsentrasi zat terlarut di dalam kedua pelarut seimbang. Pada kromatografi lapis tipis, yang digunakan sebagai fasa stasioner adalah suatu lembaran tipis silika gel.

Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik, dapat digunakan dua fase pelarut, dimana setiap jenis asam amino mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Perbandingan kecepatan perpindahan komponen dengan permukaan fasa mobile merupakan dasar untuk mengidentifikasi komponen-komponen yang dipisahkan. Oleh karena itu melalui percobaan ini akan dilakukan pengidentifikasian asam amino dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis.

1.2 Maksud dan Tujuan

1.2.1 Maksud Percobaan

Maksud dari percobaan ini yaitu untuk mengetahui cara pemisahan dan identifikasi asam amino dalam suatu sampel dengan menggunakan metode kromatografi.

1.2.2 Tujuan Percobaan

Tujuan dilakukannya percobaan ini yaitu :

1.      Menentukan nilai Rf dari asam amino (arginin, glisin, histidin) dan sampel.

2.      Mengidentifikasi asam amino dari larutan sampel melalui metode kromatografi lapis tipis.

1.3 Prinsip percobaan

Pemisahan asam amino secara kromatografi menggunakan KLT atau plat kromatografi lapis tipis yang fase gerakannya dengan menggunakan eluen yang terdiri atas campuran n-butanol, asam asetat dan air. Identifikasi dilakukan dengan membandingkan jarak noda yang dihasilkan setelah penyemprotan dengan larutan ninhidrin. Setelah itu membandingkan nilai Rf dari asam amino.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Asam amino yang merupakan monomer (satuan pembentuk) protein amino adalah suatu senyawa yang mempunyai dua gugus fungsi yaitu gugus amino dan gugus karboksil. Pada asam amino, gugus amino terikat pada atom karbon yang berdekatan dengan gugus karboksil (C-α) atau dapat dikatakan juga bahwa gugus amina dan gugus karboksil dalam asam amino terikat pada atom karbon yang sama (Tim Dosen Kimia, 2013).

Asam amino yang diperoleh dari larutan hidrolisis protein adalah asam amino α. Artinya, gugus amino berada pada atom karbon α, yaitu disebelah gugus karboksil. Kecuali glisin, dengan R = H, asam amino α memiliki pusat stereogenik pada karbon α. Dengan demikian, semua asam amino α kecuali glisin bersifat aktif optis (Lehninger, 1982).

Asam amino tidak hanya berperan sebagai bahan bangunan protein, tetapi juga merupakan sumber daya kimia bagi banyak senyawa yang membutuhkan nitrogen. Misalnya glisin diperlukan untuk biosintyesis gugus heme dari hemoglobin. Triptofan merupakan pelopor bagi suatu kelompok senyawa penting dalam biokimia system syaraf. Terosin merupakan materi pemula bagi biosintesis dari pigmen kulit melanin (Tim Dosen Kimia, 2013).

Beberapa asam amino tidak dapat disintesis dalam tubuh manusia oleh karenanya asam-asam amino tertentu harus diperoleh secara langsung dari makanan atau minuman yang dikenal sebagai asam amino esensial. Tergolong sebagai asam amino esensial adalah : Arginin, Lisin, Triptofan, Histidin, Metionin, Valin, Isolensin, Lensin, Finilalanin, Treonin, Argini dan Fenilalanin

Sangat dibutuhkan oleh bayi yang dalam pertumbuhan (Tim Dosen Kimia, 2013).

Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organik non polar seperti pada eter, aseton dan kloroform. Asam karboksilat alifatik maupun aromatik yang terdiri atas beberapa atom karbon umumya kurang larut dalam air tetapi larut dalampelarut organik (Poedjiadi, 1994).

Analisis asam amino dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa metode, salah satu diantaranya kromatografi lapis tipis. Pemisahan asam amino dengan metode ini didasari oleh kemampuan suatu jenis asam amino yang terlarut dalam suatu campuran pelarut tertentu pada fase stationer, dimana suatu zat terlarut yang terdistribusi dalam dua pelarut dengan volume yang sama dan tidak saling bercampur sehingga perbandingan konsentrasi zat terlarut didalam kedua pelarut seimbang (Soedjiadi, 1988).

Asam amino dengan satu gugus amino dan satu gugus karboksil lebih baik digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino diprotonasi dan hadir sebagai ion amonium, sedangkan gugus karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai ion karboksilat. Struktur dipolar ini konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki titik leleh yang agak tinggi (bahkan yang paling sederhana, glisina, meleleh pada suhu 233 °C) dan kelarutannya dalam pelarut organik relatif rendah). Asam amino bersifat amfoterik, artinya berperilaku sebagai asam dan mendonasikan proton pada basa kuat, atau dapat juga berperilaku sebagai basa dan menerima proton dari asam kuat. Perilaku ini dinyatakan dalam kesetimbangan berikut untuk asam amino dengan satu gugus amino dan satu gugus karboksil (Hart, 2003).

Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut (Poedjiadi, 1994).

Protein yang ditemukan kadang-kadang berkonjugasi dengan makromolekul atau mikromolekul seperti lipid, polisakarida dan mungkin fosfat. Protein terkonjugasi yang dikenal antara lain nukleoprotein, fosfoprotein, metaloprotein, lipoprotein, flavoprotein dan glikoprotein. Protein yang diperlukan organisme dapat diklasifikasikan menjadi dua golongan utama, ialah pertama; protein sederhana, yaitu protein yang apabila terhidrolisis hanya menghasilkan asam amino, dan kedua protein terkonjugasi, yaitu protein yang dalam hidrolisis tidak hanya menghasilkan asam amino, tetapi menghasilkan juga komponen organik ataupun komponen anorganik yang disebut “gugus prosthetic”  (Poedjiadi, 1994).

Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut (Poedjiadi, 1994).

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan  dengan menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah : Kromatografi Kertas (KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Gas Cair (KGC) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Meronda, 2009).

BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan Percobaan

            Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah larutan eluen (larutan n-butanol, larutan asam asetat dan air = 25 : 6 : 26 v/v ), larutan ninhidrin 2 % dan larutan asam amino (asparagin, tirosin, dan sampel).

3.2 Alat Percobaan

            Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah plat KLT (Kromatografi lapis tipis), chamber, inkubator, botol semprot, pipa kapiler (0,5 µL) microsyringe dan gelas ukur.

3.3 Prosedur Percobaan

Eluen dibuat dengan cara dicampurkan n-butanol, asam asetat, dan air dengan perbandingan 25 : 6 : 26 v/v. Kemudian larutan eluen dimasukkan ke dalam chamber dan ditutup rapat dengan selotip hingga chamber jenuh dengan larutan eluen, kurang lebih selama beberapa menit. Kemudian sebuah plat KLT dibuat garis dengan pensil  sejauh 1 cm pada bagian bawah plat dan 1 cm dari tepi atas plat. Selanjutnya, plat KLT dimasukkan ke dalam inkubator selama beberapa menit. Setelah itu, plat KLT ditotolkan larutan asam amino (asparagin, tirosin,  dan larutan sampel) dengan menggunakan pipa kapiler dengan jarak yang sama. Lalu, plat KLT dimasukkan ke dalam chamber yang sudah jenuh dengan larutan eluen, tetapi totolan larutan asam amino tidak boleh tercelup ke dalam larutan eluen. Elusi dihentikan setelah eluen menempuh jarak yang telah ditentukan sebelumnya yaitu garis ditandai dengan pensil. Plat KLT dikeluarkan dari chamber lalu dikeringkan dalam inkubator. Dengan hati-hati, kertas disemprot dengan larutan ninhidrin 2 % kemudian dikeringkan di dalam inkubator kurang lebih pada suhu 60 ^oC selama beberapa  menit. Noda yang timbul diberi lingkaran dengan pensil. Diukur jarak dari tempat totolan sampai ke noda yang terpisah. Dihitung Rf dari setiap noda.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.I  Hasil

Tabel 1. Data Hasil Pengamatan

Noda	Jarak eluen	Jarak noda (cm)	Rf  (cm)
Asparagin	-	-	-
Tirosin	6	3,7	0,616
Sampel	6	3,8	0,633

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan asam amino yang melibatkan pemisahan terhadap campuran berdasarkan perbedaan-perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya.

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut :

 R _f       = jarak noda dari tempat penotolan

           jarak yang ditempuh pelarut

Pada percobaan pemisahan dan identifikasi asam amino ini dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) dan dilakukan perhitungan nilai dengan menggunakan rumus Rf di atas. Beberapa asam amino yang digunakan  adalah alanin, glisin, asam aspartat dan asam amino sampel X.

Langkah pertama yang dilakukan adalah dengan memotong plat KLT sesuai keperluan, lalu mengaktifkannya dengan cara dimasukkan ke dalam oven pada suhu ± 60 ^oC selama ± 15 menit. Setelah itu memberi tanda pada plat KLT menggunakan pensil sebagai batas 0,5 cm antara larutan yang satu dengan yang lainnya dan beri garis 1 cm pada bagian atas plat dan 1 cm pada bagian bawah plat. Penggunaan pensil disini adalah agar tidak terjadi perembesan tinta pada plat KLT.

Langkah selanjutnya menotoli plat dengan asparagin, tirosin, dan larutan sampel. Setelah itu, plat KLT yang telah ditotoli beberapa larutan tadi dimasukan ke dalam chamber yang berisi larutan eluen (campuran air, asam asetat, dan n-butanol). Campuran ini berfungsi agar setiap asam amino dengan gugus yang berbeda dapat diidentifikasi. Adapun dipilih campuran dari bahan tersebut karena memiliki perbedaan kepolaran dengan urutan kepolaran yaitu air > n-butanol > asam asetat. Pada percobaan ini proses elusi berjalan lambat, proses elusi berakhir (eluen sampai pada base line) kurang lebih 20 menit. Setelah absorben diangkat dari eluen, kemudian dikeringkan pada suhu kamar dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin.

Berdasarkan hasil pengamatan setelah plat disemprot dengan ninhidrin 2%  diperoleh hasil yaitu pada noda tirosin, jarak eluennya 6 cm, jarak nodanya 3,7 cm sehingga diperoleh Rf = 0616. Pada noda tirosin, jarak eluennya 6 cm, jarak nodanya 3,8 cm sehingga diperoleh Rf = 0,633. Sedangkan pada sampel asparagine tidak muncul noda, hal ini mungkin diakibatkan kesalahan atau kurangnya ketelitian praktikan dalam melakukan prosedur kerja. Dari percobaan ini dapat diketahui bahwa larutan sampel memiliki Rf yang hampir sama dengan tirosin, dapat diambil hipotesa bahwa larutan sampel adalah tirosin atau senyawa asam amino yang mempunyai gugus fungsi yang mirip dengan tirosin.